Marguerite de Valois sinh tại Lâu đài de Saint-Germain-en-Laye vào ngày 14 tháng 5, năm 1553; là đứa con thứ 7 và con gái thứ ba của quốc vương Henry II của Pháp và Vương hậu Catherine; bà được các anh em trai đặt tên hiệu Margot. Ba người anh em trai của bà đều trở thành các Quốc vương nước Pháp: François II, Charles IX và Henry III.

Năm 1565, Vương hậu Catherine gặp gỡ đại xứ của Quốc vương Phillip II của Tây Ban Nha là Công tước Alba, bày tỏ hi vọng có thể sắp xếp cuộc hôn nhân giữa Margurite và con trai của quốc vương, Don Carlos, Vương công Asturias[1]. Tuy nhiên, công tước từ chối ý định ấy của Catherine.

Trong khi đó, Magurite có quan hệ tình cảm với Henry I, Công tước Guise, con trai của Cố công tước Guise[2]. Khi vương hậu phát hiện, bà đã lôi Margurite ra khỏi giường; quốc vương và vương hậu đã đánh đập Margurite để cảnh cáo và đuổi Henry Guise ra khỏi lâu đài[2].